Utilisome der Außenmembran vermitteln die Glykanaufnahme im Darm von Bacteroidetes

Natur (2023)Diesen Artikel zitieren

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Bacteroidetes sind häufig vorkommende Mitglieder der menschlichen Mikrobiota und nutzen eine Vielzahl von Glykanen aus der Nahrung und dem Wirt im distalen Darm1. Die Glykanaufnahme über die bakterielle Außenmembran dieser Bakterien wird durch SusCD-Proteinkomplexe vermittelt, die aus einem in die Membran eingebetteten Zylinder und einem Lipoproteindeckel bestehen, von dem man annimmt, dass er sich öffnet und schließt, um die Bindung und den Transport des Substrats zu erleichtern. Allerdings spielen oberflächenexponierte Glykan-bindende Proteine und Glykosidhydrolasen auch eine entscheidende Rolle bei der Erfassung, Verarbeitung und dem Transport großer Glykanketten. Die Wechselwirkungen zwischen diesen Komponenten in der äußeren Membran sind kaum verstanden, obwohl sie für die Nährstoffaufnahme unserer Darmmikrobiota von entscheidender Bedeutung sind. Hier zeigen wir, dass sich sowohl für die Levan- als auch für die Dextran-Nutzungssysteme von Bacteroides thetaiotaomicron die zusätzlichen Komponenten der äußeren Membran auf dem SusCD-Kerntransporter anordnen und stabile Glykan-verwendende Maschinen bilden, die wir Utilisomen nennen. Kryoelektronenmikroskopische Einzelpartikelstrukturen in Abwesenheit und Gegenwart von Substrat zeigen konzertierte Konformationsänderungen, die den Mechanismus der Substrateinfangung demonstrieren und die Rolle jeder Komponente im Utilisom erklären.

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Die Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind auf begründete Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich. Kryo-EM-Rekonstruktionen und entsprechende Koordinaten wurden in der Electron Microscopy Data Bank bzw. der PDB hinterlegt: substratfreies Levan-Utilisom (EMD-15288 und PDB 8A9Y), Levan-Utilisom mit FOS DP 8–12 (EMD-15289 und PDB). 8AA0), SusC2D2-Kern aus dem Levan-Utilisom mit FOS DP 8–12 (EMD-15290 und PDB 8AA1), inaktives Levan-Utilisom mit FOS DP 15–25 (EMD-15291 und PDB 8AA2), SusC2D2-Kern aus inaktivem Levan-Utilisom mit FOS DP 15–25 (EMD-1592 und PDB 8AA3), Dextran-Utilisom-Konsensusverfeinerung (EMD-15293 und PDB 8AA4). Koordinaten und Strukturfaktoren aus Röntgenkristallographieexperimenten für GHlev wurden im PDB unter den Zugangscodes 7ZNR und 7ZNS hinterlegt. Die Massenspektrometrie-Proteomikdaten wurden über das PRIDE-Partner-Repository mit der Datensatzkennung PXD034863 beim ProteomeXchange-Konsortium hinterlegt. Rohdaten dieser Studie sind im University of Leeds Data Repository verfügbar: https://doi.org/10.5518/1329. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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JBRW wurde durch ein vierjähriges Doktorandenstipendium des Wellcome Trust (215064/Z/18/Z) unterstützt. BvdB wird finanziell durch einen Wellcome Trust Investigator Award (214222/Z/18/Z) unterstützt, die Unterstützung von AS und YZMF wird durch ein Stipendium der Newcastle University unterstützt. Wir danken der Diamond Light Source (Didcot, UK) für die Strahlzeit (Vorschläge mx306, mx1221, mx13587 und mx18598) und danken den Mitarbeitern der Strahllinien I02, I03, I04 und I24 für die Unterstützung. Die gesamte Kryo-EM wurde im Astbury Biostructure Laboratory durchgeführt, das von der University of Leeds und dem Wellcome Trust (108466/Z/15/Z und 221524/Z/20/Z) finanziell unterstützt wurde. Wir danken R. Thompson, E. Hesketh und D. Maskell für die Unterstützung bei der Elektronenmikroskopie. Die Protein-ID-Massenspektrometrie wurde an der Mass Spectrometry Facility der University of Leeds durchgeführt. Wir danken J. Ault und R. George für die Durchführung dieser Analyse. Zum Zweck des offenen Zugangs haben die Autoren eine öffentliche CC BY-Urheberrechtslizenz auf alle vom Autor akzeptierten Manuskriptversionen angewendet, die sich aus dieser Einreichung ergeben.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Joshua BR White, Augustinas Silale

Astbury Centre for Structural Molecular Biology, Fakultät für Biowissenschaften, University of Leeds, Leeds, Großbritannien

Joshua BR White & Neil A. Ranson

Biowissenschaftliches Institut, The Medical School, Newcastle University, Newcastle upon Tyne, Großbritannien

Augustinas Silale, Matthew Feasey, Tiaan Heunis, Yiling Zhu, Hong Zheng, Akshada Gajbhiye, Susan Firbank, Arnaud Baslé, Matthias Trost, David N. Bolam und Bert van den Berg

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JBRW führte Kryo-EM durch und bestimmte Kryo-EM-Strukturen, überwacht durch NARAS-gereinigte Proteine, bestimmte Röntgenkristallstrukturen und führte ITC durch, überwacht durch BvdBMF-gereinigte Proteine. YZ bereitete OM-Proben für die Proteomik vor. TH und AG führten Proteomik durch, überwacht von MTHZ, gereinigtem Bt1760, überwacht von DNBSF, und sammelten Röntgenkristallographiedaten für Bt1760. AB löste Bt1760-Kristallstrukturen und leitete das Newcastle Structural Biology Laboratory. BvdB erzeugte B. theta-Stämme, reinigte Proteine und kristallisierte Bt1761. JBRW, AS, DNB, BvdB und NAR haben das Manuskript geschrieben.

Korrespondenz mit Bert van den Berg oder Neil A. Ranson.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature dankt Mirjam Czjzek, Stephen Withers und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

(a) Organisation des Levan-PUL mit Darstellung der relativen Genpositionen innerhalb des PUL, mit angegebenen Funktionen. Die vier OM-assoziierten PUL-Komponenten (SusClev, SusDlev, GHlev und SGBPlev) werden durch das graue Kästchen hervorgehoben. Dargestellt ist eine Röntgenstruktur von GHlev (Bt1760; GH32-Endo-Levanase) (blau; PDB-ID: 7ZNR). Das von AlphaFold2 vorhergesagte Modell für SGBPlev (Bt1761) ist (rosa) so ausgerichtet dargestellt, dass sich der N-Terminus unten und die vorgeschlagene (C-terminale) Levan-Bindungsdomäne oben befindet. Beachten Sie, dass die N-Termini von GHlev und SGBPlev lipidiert und mit der äußeren Packungsbeilage des OM assoziiert werden. Dargestellt ist die Kryo-EM-Struktur des dimeren SusCDlev-Komplexes im offenen Zustand (SusClev ist grün, SusDlev ist grau). (b) Organisation des Dextran-PUL, die Genpositionen innerhalb des Locus mit markierten Funktionen zeigt. OM-assoziierte PUL-Komponenten sind grau umrahmt. Von AlphaFold2 vorhergesagte Modelle für GHdex (Bt3087; GH66-Endo-Dextranase), den mutmaßlichen SGBPdex (Bt3088) und den SusCDdex-Komplex sind wie für den Levan-PUL in (a) farbig dargestellt. (c) SDS-PAGE der zuvor untersuchten Probe von LDAO-gereinigtem SusCDlev10 vor (Sternchen) und nach dem Kochen. Die gekochte Probe zeigt zusätzlich zu denen für SusClev und SusDlev zwei schwache Banden, die anschließend durch Massenspektrometrie als GHlev und SGBPlev identifiziert wurden. (d) Ein Klassendurchschnitt, der während der 3D-Klassifizierung des Levan-SusC2D2-Kernkomplexes erhalten wurde. Die SusC- und SusD-Komponenten (grün bzw. grau) werden in der Dichte angedockt. Ein großer Dichtebereich bleibt unbelegt (orange). (e) Isolierte Ansicht der zuvor nicht zugeordneten Dichte mit der Kristallstruktur von GHlev (blauer Cartoon), eingepasst in die EM-Dichte (blau) als starrer Körper. Die verbleibende Dichte wurde daher SGBPlev zugeschrieben und ist magentafarben.

Quelldaten

(a) Ausgabe der ersten Runde der 3D-Klassifizierung für Apo-Utilisom-Daten. Gelbe, violette und rosafarbene Klassen repräsentieren den Oktamer-Komplex, also das vollständige Oktamer-Utilisom. Die grüne Klasse zeigt die zusätzlichen Lipoproteine, die mit nur einer SusC-Einheit assoziiert sind, während die blaue Klasse zeigt, dass ein kleiner Anteil des SusC2D2-Kernkomplexes vorhanden war. (b) Ausgabe der 3D-Klassifizierung für das Levan-Utilisom mit einer aktiven Levanase in Gegenwart von FOS DP8-12. Es wurden Klassen (in der Ebene der Membran betrachtet) beobachtet, die Partikel des vollständigen oktameren Komplexes enthielten (blau und grün), sowie hexamere Komplexe, die eine einzelne Kopie von SGBPlev und GHlev enthielten (rosa und gelb). Eine Klasse, die SusCDlev isoliert enthält, ist ebenfalls vorhanden (lila). (c) Ergebnisse der 3D-Klassifizierung für lange FOS (DP15-25), die zeigen, dass SGBPlev eine „angedockte“ Konformation in der Nähe von SusD und Levanase annehmen kann. (d) Eine Konsensverfeinerung aller Klassen, die mindestens ein angedocktes SGBP enthalten (gelb, rosa, cyan und grün in Panel (c)). Um den interessierenden Bereich herum wurde eine Maske erstellt (transparentes Gelb). (e) Ausgaben der fokussierten Klassifizierung für den maskierten Bereich ohne Ausrichtung. Eine Klasse, die eine hohe Auflösung für den interessierenden Bereich anzeigt, ist mit einem roten Sternchen gekennzeichnet. Unabhängige Halbkarten wurden unter Verwendung unmaskierter Partikel dieser Klasse rekonstruiert. (f) Geschärfte Rekonstruktion, erstellt mit den oben genannten Halbkarten, die eine verbesserte Dichte für SGBPlev zeigt.

(a) 3D-Klassifizierung des Apo-Levan-Utilisoms, betrachtet von außerhalb der Zelle. SusClev (grün), SusDlev (grau), SGBPlev (magenta) und GHlev (blau). Die Klassen werden anhand ihrer SusDlev-Deckelpositionen getrennt. Offene Zustände Wide-Wide (WW), Normal-Wide (NW) und Normal-Normal (NN) (von links nach rechts) (b) Überlagerung der offenen Zustände Wide (SusD grau) und Normal (SusD orange) des Komplex. (c) Überlagerung von Atommodellen für den Normalzustand gegenüber dem weit geöffneten Zustand, erzeugt durch eine Starrkörperanpassung von SusDlev in die KryoEM-Dichte. Aus Gründen der Übersichtlichkeit wird ein Monomer angezeigt und ein Sternchen markiert in beiden Modellen dieselbe SusDlev-Helix. (d) Eine Ansicht der Utilisomen bei hoher Schwelle in der Ebene der Membran (links). Verschiedene Konformationen des SGBPlev, die bei der 3D-Klassifizierung beobachtet wurden, werden überlagert, um die Flexibilität dieser Untereinheit zu demonstrieren (eingerahmter Bereich). Die gleiche Ansicht wird um 90° gedreht angezeigt (rechts). Die ungeordnete Mizellendichte wird als durchscheinendes Grau dargestellt. (e) Variabilität der SGBPlev-Position in den substratgebundenen Utilisomen mit kurzem FOS (~DP8-12) und aktivem GHlev und langem FOS (DP15-25) mit inaktivem GHlev. Ein neuartiger Zustand wird in einzigartiger Weise in der langen FOS-Struktur beobachtet, wobei ein SGBPlev (orange) über den SGBPlev reicht und diesen kontaktiert, der mit der anderen SusC-Untereinheit verbunden ist, die in einem angedockten Zustand vorliegt. Diese Konformation steht im Einklang damit, dass beide SGBPlev-Untereinheiten im Utilisom mit derselben Substratkette interagieren.

a, Anordnung von GHlev und SGBPlev auf SusC im Levan-Utilisom. GHlev stellt Kontakte mit der extrazellulären Schleife 1 (Gold) und der extrazellulären Schleife 9 (rot) her, während SGBPlev nur Kontakte mit der extrazellulären Schleife 1 herstellt. b, Anordnung von GHdex und SGBPdex auf SusC im Dextran-Utilisom. Hier ist die extrazelluläre Schleife 1 von SusCdex die primäre Interaktionsstelle für GHdex, während die extrazelluläre Schleife 9 die Schnittstelle zu SGBPdex umfasst. Der Übersichtlichkeit halber ist jeweils eine Hälfte des Utilisoms dargestellt, SusD-Komponenten wurden weggelassen. Beachten Sie, dass das Dextran-Utilisom-Modell eine Kombination aus Kryo-EM-Strukturen (SusCdex) und vorhergesagten Modellen von AlphaFold2 (GHdex und SGBPdex) ist.

Seitenansicht (a) und Draufsicht (b) der Karte des heptameren Dextran-Utilisoms. Gezeigt werden die identischen Seitenansichten (c) und Draufsichten (d) eines zusammengesetzten Atommodells für Dextran-Utilisom. KryoEM-Daten ermöglichten eine Verfeinerung von SusCdex. AlphaFold2-Strukturvorhersagen für SusDdex und GHdex wurden in die KryoEM-Karte für den heptameren Komplex angedockt. Eine AlphaFold2-Strukturvorhersage für einen Teil von SGBPdex wurde ebenfalls an die KryoEM-Karte angepasst. Eine eindeutige Dichte war nur für die ersten beiden Domänen von SGBPdex sichtbar und das vorhergesagte Modell wurde vor der C-terminalen Domäne gekürzt. SusCdex = Lila, SusDdex = Pink, GHdex = Cyan und SGBPdex = Grün. Die Verfeinerung des heptameren Komplexes hatte eine globale Auflösung von 3,1 Å. (e) Verfeinerte Ergebnisse der 3D-Klassifizierung, wobei jede Karte einer eindeutigen Ergänzung oder Anordnung von Hilfskomponenten (wie beschriftet) entspricht. (f) Schematische Darstellung der Architektur für zwei Apo-Glykan-Utilisome. Das Levan-Utilisom (links) ist wie im Haupttext gefärbt (SusClev = Grün, SusDlev = Grau, GHlev = Blau und SGBPlev = Magenta). Das entsprechende Schema für das substratfreie Dextran-Utilisom befindet sich rechts. Beachten Sie die unterschiedliche Anordnung der GH- und SGBP-Komponenten relativ zu SusD in den Levan- und Dextran-Systemen.

(a) Isolierte FOS-Dichte, erhalten aus dem Levan-Utilisom-Datensatz mit aktivem GHlev und kurzem FOS (DP8-12)12. Die Dichte des Substrats (gelb) wird bei hohen (links) und niedrigen (rechts) Schwellenwerten angezeigt. (b) Isolierte FOS-Dichte, erhalten aus der Utilisom-Struktur mit inaktivem GHlev und langem FOS (DP15-25). Die Levandichte (orange) wird bei hohen (links) und niedrigen (rechts) Schwellenwerten angezeigt. Pfeile zeigen fehlende Fructosezweige im Vergleich zu (a) an. An der FOS1-Stelle fehlt die Dichte für die mutmaßliche β2,1-Dekoration auf Frc4. Umgekehrt geht die zusammenhängende Dichte über die zuvor aufgelöste Dichte bei FOS2 hinaus, mit einer neuartigen β2,1-Dekoration auf Frc5. Das an der FOS2-Stelle gebundene Substrat folgt einem ähnlichen Trend, wobei die zuvor modellierte β2,1-verknüpfte Fructose-Seitenkette bei längerem FOS viel schwächer ist, während die zusätzliche Dichte, die einem anderen β2,6-verknüpften Monomer zugeschrieben wird, die Kette in Richtung der FOS1-Stelle verlängert. Bei höheren Schwellenwerten verbindet die Dichte die FOS1- und FOS2-Bindungsstellen, was darauf hindeutet, dass längeres FOS (~DP15) beide Stellen gleichzeitig besetzen kann. Die Verbindungsdichte ist schwach und weist auf mehrere Konformationen hin, was mit dem Fehlen jeglicher Kontakte von SusClev zu diesem Segment übereinstimmt. Diese Daten bestätigen, dass der Transporter eine beträchtliche Promiskuität bei der Substratbindung aufweist und dass, wie bereits vermutet, relativ lange FOS (~15 DP) aufgenommen werden können12. Die gezeigten FOS-Modelle stammen aus der ursprünglichen Röntgenkristallstruktur des SusCDlev-Komplexes, die in Gegenwart von kurzem FOS (DP6-12)12 bestimmt wurde. (c) Kryo-EM-Struktur des inaktiven GHlev mit gebundenem FOS (blau), überlagert mit den beiden Kristallstrukturen (7ZNR und 7ZNS; orange, grau). (d, e) Vergleich von FOS, das an den Bindungsstellen FOS3 (das aktive Zentrum) und FOS4 (sekundär) von GHlev gebunden ist. Die Pfeilspitzen deuten auf Brüche in der FOS-Kette in den Kristallstrukturen hin, möglicherweise als Folge der Verwendung eines niedrigeren DP-FOS für die Co-Kristallisation als für Kryo-EM. Die Ansichten in (d) und (e) werden aus einer Überlagerung generiert.

(a) Die Titration von 1 mM FOS definierter Länge in 50 μM Wildtyp-SGBPlev legt nahe, dass ~15 Fruktoseeinheiten für die volle Affinität erforderlich sind, die durch die WAWA-Mutation (W297A/W359A) aufgehoben wird. (b) ITC-Titrationen von 8 mg/ml Levan, Inulin oder Dextran 500 in 50 μM SGBPlev zeigen seine Spezifität für Levan. (c) ITC-Daten aus Titrationen von GHlev-Varianten (alle angegebenen Reste mutierten zu Alanin im inaktiven D42A-GHlev-Hintergrund). Levan (8 mg/ml) wurde in 50 μM der angegebenen GHlev-Variante titriert. Annahmen zur Datenanpassung werden in den Methoden beschrieben. (d) Oberflächendarstellung des GHlev-Modells, wobei FOS als gelbe Stäbchen dargestellt sind. Eingefügt sind vergrößerte Ansichten der Bindungsstellen FOS3 (aktives Zentrum) und FOS4 (sekundär), in denen Atommodelle in Cartoon-Darstellung für FOS3 mit Seitenketten für aromatische Reste (Y70A, W318A) gezeigt werden. Für die sekundäre Bindungsstelle sind diese Reste W217A, F243A, Y437A.

Quelldaten

a, Übersicht und b, Nahaufnahme der SGBPlev FOS-Bindungsstelle. Die aromatischen und polaren Reste, die wahrscheinlich mit dem FOS interagieren, sind als graue Stabmodelle dargestellt. Die Kryo-EM-Struktur von SGBPlev wurde mit ausgewählten homologen, von AlphaFold2 vorhergesagten Modellen abgeglichen (c–f). c, Bacteroides sp. D2 SGBPlev (UniProt E5CCB3). d, Prevotella oralis ATCC 33269 SGBPlev (E7RM14). e, Flavobacterium commune SGBPlev (A0A1D9P8I4). f,F. cellulosilyticum SGBPlev (A0A4R5CJN9). FOS-bindende Reste, die denen in b entsprechen, sind als graue Stabmodelle dargestellt (falls vorhanden). Die FOS-Kette aus dem SGBPlev-Kryo-EM-Modell ist als Referenz in b–f dargestellt (orange und rot). Die in jedem Panel angegebene Identität entspricht nur der C-terminalen Levan-Bindungsdomänensequenz im Vergleich zu SGBPlev aus B. theta. Obwohl wir anhand der Kryo-EM-Karten nicht sicher identifizieren konnten, welche SGBPlev-Reste Wasserstoffbrückenbindungen mit FOS bilden, deutet die Analyse der Bindungsstellenkonservierung darauf hin, dass N295, T350, Q352 und N384 von SGBPlev wahrscheinlich an der FOS-Bindung beteiligt sind. Das Aminosäuresequenz-Alignment der hier gezeigten Modelle ist in der ergänzenden Abbildung 3 zu finden.

Diese Datei enthält die ergänzende Diskussion, Abb. 1–4 und Referenzen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

White, JBR, Silale, A., Feasey, M. et al. Utilisome der Außenmembran vermitteln die Glykanaufnahme im Darm von Bacteroidetes. Natur (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-06146-w

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Eingegangen: 08. Juli 2022

Angenommen: 27. April 2023

Veröffentlicht: 07. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-06146-w

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